¿Qué métodos utilizan en sus laboratorios para hacer los diagnósticos?
Las técnicas en ADL las tenemos dividas en 2 tipos, directas e indirectas. Las técnicas directas corresponden a aquellas que el patógeno se observa directamente o se aísla o concentra y que en general tiene tiempos de respuesta en días o semanas. Las técnicas indirectas o rápidas, son aquellas que permiten detectar un metabolito o parte del patógeno (enzima o material genético) y que en general están listas en minutos o bien horas.
Por otro lado, la selección de una técnica está relacionada con 4 aspectos fundamentales y corresponden al propósito, efecto del fundamento, tipo muestra y tipo resultado. Los criterios en ADL permitirán escoger la técnica mása conveniente. Según el propósito, como ejemplo la detección de bacterias patógenas en reproductores, usamos técnicas de muy alta sensibilidad como PCR o RT-PCR tiempo real por química hidrólisis de sonda. La razón es que los reproductores son portadores y las cargas de los patógenos bacterianos son muy bajas. Si el propósito es confirmar una enfermedad bacteriana, la técnica que presenta mayor sensibilidad actualmente es una técnica indirecta o rápida, ya expuesta, el PCR tiempo real. Si el propósito es tener un diagnóstico de urgencia se utilizan técnicas indirectas y que permiten tener un diagnóstico rápido (Ejm: PCR). Por otro lado, si se sospecha de una enfermedad bacteriana desconocida y posiblemente emergente o exótica, así como posibles bacterias fastidiosas (requieren medios enriquecidos para crecer) o no fastidiosas, se utilizan técnicas directas, como la observación directa por microscopía, como tinción Gram, en histopatología e incluso paralelamente el cultivo bacteriológico en distintos medios de cultivo, según tipo de agua (dulce, estuario o mar). Por otro lado, el efecto del fundamento repercute directamente sobre la sensibilidad y el límite de detección de la técnica. Las técnicas en base a microscopía son las menos sensibles y las más sensibles son aquellas que amplifican el material genético (como el PCR). El tipo de muestra es muy importante, si se necesita aislar un agente es esencial que la muestra (pez, tejido) sea muy fresca, otras requieren ser tomadas en terreno para evitar cambios en la morfología u otras el uso de tejidos como es el caso de aquellas en las que se realiza análisis histopatológicos. El tipo de resultado es muy importante, algunas técnicas entregan resultados cualitativos y otras cuantitativos. Los resultados cualitativos son binarios, es decir, positivo/negativo, presente/ausente, detectado/no detectado y, en general, sirven para confirmar o descartar la presencia de agentes bacterianos. Las técnicas cuantitativas, en cambio, presentan magnitud de medida tales como unidades formadoras de colonia por ml (ufc/ml), en el caso de los recuentos, o copias DNA por gramo de muestra, en el caso de PCR. En general, sirven para hacer seguimiento y así evaluar tendencias, como por ejemplo el resultado de una terapia en el tiempo. De esta manera, es posible saber si las bacterias incrementan, mantienen o reducen su carga durante un periodo determinado.
Dentro de las técnicas indirectas más utilizadas por ADL, y la industria en general, se encuentra la PCR o reacción en cadena de la polimerasa, específicamente en formato tiempo real y resuelta mediante química TaqMan (hidrólisis de sonda). Dependiendo de la naturaleza del material genético del agente a identificar, se puede utilizar PCR para DNA o RT-PCR para RNA, pero en ADL utilizamos mayoritariamente RT-PCR para todos los diagnósticos bacterianos. La razón es simple, nosotros realizamos extracción de material genético (RNA+DNA) de peces infectados por bacterias, y en general las bacterias, tienen una o pocas copias del gen target pero pueden tener cientos o miles de RNA mensajeros o mRNA, nosotros detectamos ambas al mismo tiempo incrementando sustantivamente la sensibilidad de la técnica. Por otro lado, los termocicladores tiempo real tienen varios canales de detección de distintos fluoróforos (4 o 5 en promedio) y se puede asignar un fluoróforo distinto (FAM, CY5, HEX, etc..) por cada patógeno a detectar, pasando de una PCR de detección única a una PCR múltiple en una sola reacción.
Adicionalmente, si el objetivo es evaluar la expresión de un gen del patógeno bacteriano o un gen del salmón afectado, se mide el RNA mensajero (mRNA) utilizando una enzima (retrotranscriptasa) que transcribe el RNA en cDNA (DNA complementario) y luego se utiliza la PCR para amplificar ese cDNA. En general, para cuantificar utilizamos 2 metodologías: cuantificación relativa y absoluta. La primera, permite comparar los resultados entre las distintas muestras usando un gen constitutivo del salmón (ELA-1a, b-actina, GADPH) que se utiliza como normalizador, luego de lo cual se puede comparar una muestra con respecto a otra en términos de la relación que existe entre ellas respecto del gen normalizador, es decir, este tipo de cuantificación no tiene magnitud de medida y se representa en función de cuantas veces más alta o más baja es la relación entre el gen de interés y el gen normalizador para las distintas muestras.
Por otro lado, en ADL también usamos cuantificación absoluta, la cual permite medir el número de copias del gen por reacción de PCR o extrapolarlo a copias por gramo de tejido o unidad de volumen, si se trata de un líquido. En este caso, se utiliza material genético de referencia, del cual se conoce el número de copias exactas por volumen, generalmente sintetizado y purificado mediante HPLC. Con este material de referencia, se genera una curva de calibración con concentraciones conocidas y luego, mediante la interpolación de los resultados de cada muestra, se calcula el número de copias por reacción para cada una de ellas.
Por otra parte, en ADL utilizamos la PCR no solo para detectar o cuantificar la expresión de un gen o el número de bacterias, sino también para detectar mutaciones en los genomas bacterianos. Estas mutaciones pueden estar relacionadas por ejemplo a la resistencia a determinados antibióticos o relacionados con la virulencia de las bacterias patógenas. Para detectar las mutaciones, en general utilizamos ácidos nucleicos modificados en las sondas de PCR (LNA) u otras químicas como RNAsa H. Un ejemplo de esto último corresponde a ATBPlex®, una técnica desarrollada, validada y patentada por ADL hace cinco años aproximadamente, la cual permite determinar mutaciones específicas en el genoma de Piscirickettsia salmonis, relacionadas con la susceptibilidad de la bacteria a determinados antibióticos de uso frecuente. Adicionalmente, el análisis de las mutaciones o variantes simples (SNV) o múltiples (MNV), nos permiten no solo diferenciar una especie bacteriana de otra sino también identificar diferentes genogrupos e incluso genovariantes de la misma especie. En el caso de Piscirickettsia salmonis, por ejemplo, podemos diferenciar 2 genogrupos cuyas cepas tipo han sido descritas como LF89 y EM90, respectivamente, o incluso diferenciar los genogrupos en genovariantes, las que hasta el día de hoy son 6 (I a VI) y que presentan diferencias entre sí en términos de virulencia, frecuencia, tropismo por determinadas especies, temperatura, distribución geográfica y susceptibilidad a los antibióticos (epidemiología molecular); herramientas que han sido desarrolladas por ADL de manera exclusiva.
Finalmente, en ADL no solo contamos con técnicas para la detección de patógenos desde los peces y sus distintos tejidos, sino que también hemos desarrollado técnicas especialmente destinadas a evaluar la presencia de patógenos en el ambiente, a partir de matrices más complejas como el agua de mar o el agua dulce, las superficies, las redes, los equipos, los huevos, las máquinas o la infraestructura en general. Dentro de este último grupo de técnicas principalmente nos preocupamos de incrementar la sensibilidad y especificidad diagnósticas, debido su alto impacto en términos de bioseguridad. En este contexto, ADLMag® es una técnica desarrollada, validada y patentada por ADL hace poco más de una década, cuya principal característica es que concentra los patógenos bacterianos como P.salmonis, R.salmoninarum, F.psychrophilum y T.dicentrarchi (cluster) desde matrices complejas, con alto contenido orgánico (sedimentos, superficies, etc.) permitiendo así incrementar ostensiblemente la detección de patógenos en este tipo de muestras (1.000 a 10.000 veces más que un PCR). Así también, la ultrafiltración tangencial (UFT) implementada y validada en ADL hace casi diez años, nos permite detectar el agente en matrices de gran volumen y con bajo contenido orgánico (agua dulce, estuario o mar). La detección de patógenos bacterianos en el ambiente a través de recuentos directos o bien por ADLMag® o UFT, permiten entre otros evaluar las desinfecciones realizadas a los centros de cultivo o pisciculturas o evaluar distintos desinfectantes o métodos de desinfección como UV u Ozono, evaluar potenciales agentes en afluentes, etc; aplicaciones estandarizadas y validadas a través de proyectos CORFO específicos, a inicios de la década pasada.
¿Con qué rapidez son capaces de hacerlo?
En este punto es muy importante considerar que laboratorios como ADL están diseñados para realizar análisis masivos, cientos o miles por día y aunque la PCR es una técnica indirecta y rápida y que es posible tener los resultados en un par de horas, en general los tiempos de respuesta están entre 24 a 48 horas, considerando el número, volumen y diversidad de muestras a procesar, el número de personas que ejecutan los ensayos, los protocolos de calidad, la preparación de las ordenes de trabajo y la validación de los informes. En el caso de los cultivos bacterianos depende si las bacterias son fastidiosas o no y del medio a utilizar. Las bacterias fastidiosas como Piscirickettsia salmonis o Renibacterium salmoninarum, que requieren de medios enriquecidos, generalmente toman entre 1 a 4 semanas en crecer y luego la identificación respectiva toma 1 o 2 días más. En el caso de las bacterias no fastidiosas como Flavobacterium psychrophilum, Tenacibaculum dicentrarchi (cluster), Aeromonas salmonicida o Yersinia ruckeri toma en general entre 3 a 5 días el crecimiento en medios de baja complejidad.
¿Cómo lo hacen para diferenciar entre las diferentes cepas de las enfermedades bacterianas?
Nosotros utilizamos un conjunto de pasos o algoritmo dependiendo de la complejidad de la identificación bacteriana. Para las bacterias enzoóticas (frecuentemente aisladas en Chile) utilizamos PCR altamente específicos y sensibles y dependiendo del cuerpo de agua y de los signos clínicos o comportamiento de los peces somos capaces de dirigir aún más la ejecución de estos PCRs para dichos agentes. Sin embargo, cuando nos enfrentamos a una enfermedad que presenta signos clínicos distintos a los conocidos podría tratarse de una enfermedad bacteriana exótica (enfermedad introducida a Chile desde otro país) o emergente (bacteria local que adquirió factores de virulencia que la transformó en patogénica) o incluso nueva. Para ello, en general, se realizan cultivos bacterianos de todo tipo, microscopia de campo claro y pruebas específicas para descartar todos las bacterias enzoóticas. Si la bacteria desconocida crece en los medios de cultivo, en ADL generalmente realizamos secuenciamiento SANGER desde una región variable del gen ribosomal 16s rDNA utilizando nuestro equipo ABI PRISM 310 o bien secuenciamos el genoma completo en nuestros equipos para NGS, MiSeq (Illumina) o MiniOn (Oxford Nanotechnologies). Luego de secuenciar los genes o genomas, las secuencias son comparadas contra bases de datos globales para así determinar exactamente la identidad de la bacteria, pudiendo incluso encontrar una bacteria patógena totalmente nueva o no reportada previamente; análisis bioinformáticos realizados por expertos, los cuales forman parte de nuestro staff, así como sistemas computacionales altamente sofisticados (supercomputadores) que nos permiten actualizar a diario toda la información del banco de genes mundial (de USA, Europeo, Japonés, etc).
Por otra parte, si no fue posible aislar el agente bacteriano desde los peces, porque no se contó con el medio o las condiciones adecuadas para su aislamiento, es posible realizar Metagenómica bacteriana. La metagenómica bacteriana se realiza en un secuenciador masivo, como MiSeq o MiniOn, para lecturas largas y a través de ellas se realiza el estudio de los genes de distintas bacterias presentes en una muestra. En general, la metagenómica directa desde los tejidos puede ser realizada desde tejidos expuestos como aletas, piel y branquias donde el patógeno puede estar mezclado con las bacterias del microbiota o tejidos pertenecientes a órganos internos (hígado, corazón, riñón, etc) donde posiblemente el patógeno esté solo o acompañado por unas pocas bacterias de la flora.
¿Cómo reciben las muestras para hacer los estudios? Teniendo en cuenta que hay centros de cultivo que están muy alejados. ¿Practican la telemedicina?
Las muestras para técnicas indirectas, como la PCR, fijadas o preservadas en etanol y mantenidas a temperatura de refrigeración pueden fácilmente durar un par de semanas, lo cual hace que la PCR tenga una enorme ventaja sobre el resto de las técnicas sobretodo para aquellos centros más alejados. Con respecto a las técnicas directas como cultivo bacteriológico, es necesario tomar las muestras frescas y para ello, en general, se requieren peces que bajo temperatura de refrigeración no hayan pasado más de 12 horas, a menos que lleguen los peces vivos al laboratorio, lo que habitualmente solo se puede conseguir con peces de agua dulce en sus etapas tempranas. Para los centros más alejados, si existen las instalaciones apropiadas, es posible instalar un laboratorio provisorio para tomar las muestras, cultivarlas y transportar las placas posteriormente al laboratorio, independiente de la distancia, manteniendo las condiciones adecuadas para cada bacteria. De cualquier modo, hemos además preparado técnicamente a veterinarios para que asistan a los centros lejanos en casos específicos, cuando las condiciones son complejas y aumentan de manera notable las posibilidades de aislamiento.
Con respecto a la telemedicina, nosotros tenemos una alianza de trabajo con el laboratorio VeHiCe quienes realizan los análisis histopatológicos y ellos cuentan con un reconocido sistema nacional e internacional de análisis histopatológico por telemedicina, donde histopatólogos del país y sobre todo del extranjero pueden analizar las imágenes histopatológicas directamente desde sus oficinas en cualquier lugar del mundo.
¿Qué pasa, en esos casos, si la muestra llega mala?
En ADL, como primer filtro aplicamos ciertos criterios técnicos como el tiempo y temperatura de transporte y recepción, tipo de embalaje, integridad del tejido, entre otros, los cuales que se chequean en cada recepción y permiten definir a priori si las muestras son aptas o no para análisis. Como segundo filtro, para evaluar la calidad de la muestra, utilizamos la amplificación de genes constitutivos del salmón, como el factor de elongación (ELF-1a), los cuales deben mantenerse en un determinado rango de valores de Ct. En el caso de los cultivos bacteriológicos, es algo más complejo aunque es posible identificar si una muestra no es buena cuando es polimicrobiana y/o dependiendo del tipo de bacteria que se desarrolla en el medio de cultivo. Generalmente, estos antecedentes se dan a conocer a nuestros clientes en cada nivel o filtro que tenemos, para que ellos tengan estos datos en consideración cuando analicen los resultados o cuando se decide no analizar las muestras, en el caso del primer filtro.
¿Están capacitando gente en los centros? ¿Tienen encargados para ciertas zonas o barrios?
Efectivamente, mantenemos programas de capacitación para nuestros clientes como complemento a las visitas realizadas por nuestro equipo técnico-veterinario tanto en el marco de los muestreos correspondientes a Programas Oficiales como en visitas específicas de asistencia técnica veterinaria o proyectos de Investigación. Así también, realizamos actividades de capacitación en técnicas diagnósticas mediante visitas guiadas a nuestros laboratorios, especialmente destinadas a los nuevos profesionales o técnicos que se incorporan a las distintas empresas a las que prestamos servicios. ADL tiene tres sedes, ubicadas en Villarrica, Puerto Montt y Puerto Aysén, las cuales poseen laboratorios debidamente acreditados ISO:17025 y cuentan con el personal especializado para resolver materias analíticas, técnicas y operacionales para cada una de las zonas según su específicas necesidades. Una característica muy relevante para ADL es que nuestros especialistas poseen amplia, larga y reconocida experiencia, entre 7 a 20 años en ADL, y es su principal patrimonio.
¿Qué efectividad y precisión entregan sus técnicas de diagnóstico?
Las técnicas que se utilizan hoy en ADL, como el PCR tiempo real, son de muy alta sensibilidad, es decir, son capaces de detectar la presencia de muy bajas cantidades del agente en una muestra, además y con respecto a la especificidad son altamente selectivas, es decir con capaces de detectar el agente en presencia de productos interferentes, son altamente exclusivas lo que significa que detectan solo la especie bacteriana que se quiere buscar y no otra, y al mismo tiempo son altamente inclusivas ya que son capaces de detectar las distintas cepas o variantes de la misma especie bacteriana. Adicionalmente, las técnicas son altamente robustas, es decir los resultados son altamente repetibles (el resultado presenta alta precisión [las repeticiones tienen valores muy cercanos entre sí] cuando se corren varias réplicas de la muestra original) y altamente reproducibles (distintos analistas, distintos equipos, distintos reactivos, distintos lotes de reactivos y materiales, distintos días, distintas condiciones ambientales generan resultados con alta precisión). Además, los resultados de PCR presentan una alta exactitud, lo que corresponde a la combinación de alta precisión y alta veracidad (los resultados de las repeticiones son muy parecidos al valor de referencia), todo esto se ha demostrado en las validaciones de cada una de las técnicas realizadas en el marco de las acreditaciones ISO 17.025 y los ensayos de aptitud realizados por entidades de referencia tanto nacionales como extranjeras. Adicionalmente, a estos aspectos e independiente de la técnica, se controla la incertidumbre no aleatoria de la medición que puede alterar el resultados en las distintas etapas del análisis, considerando la toma de muestra, transporte de la muestra, pre-procesamiento de la muestra, calibración de equipos y aparatos, capacitación del personal, barreras físicas de contención del laboratorio, presión positiva/negativa para minimizar la contaminación, procedimientos, instructivos y registros que permitan asegurar las buenas prácticas del laboratorio y la trazabilidad total para lograr detectar exactamente los problemas a tiempo.
Finalmente, enfatizar que para ADL la bacteriología ha sido un área en donde hemos invertido bastante y por muchos años, no sólo en tecnología sino en especialistas de mucho conocimiento y experiencia, de manera que junto a las tecnologías aplicadas dan respaldo de una alta efectividad y precisión; algo que nuestros clientes pueden dar fe. Además, parte de nuestros hitos los vamos transferiendo en publicaciones científicas en revista del más alto nivel, por ello tenemos más de 15 publicaciones en materia de bacterias y enfermedades bacterianas, y descubierto por primera vez en Chile algunas de ellas.
