En salmones:

Tecnologías y avances en el diagnóstico de enfermedades bacterianas

Los laboratorio de diagnóstico presentes en Chile han implementando, constantemente, nuevos desarrollos tecnológicos. Este esfuerzo es muy valorado, puesto que la detección temprana y eficiente de enfermedades es un factor clave para un buen manejo sanitario. 

La industria salmonicultora chilena convive, día a día, con diversos tipos de patógenos. En el ámbito de las enfermedades bacterianas, las que aparecen con mayor frecuencia son la Piscirickettsiosis​, la Enfermedad Bacteriana del Riñón (BKD) y Tenacibaculosis; esta última se ha hecho más frecuente en los últimos años.

La clave, para un buen tratamiento, está en detectar tempranamente estas enfermedades. Para ello, la industria cuenta con una amplia red de laboratorios de diagnóstico que están constantemente implementando mejoras, con el fin de prestar un servicio más rápido y preciso, que ayude a tomar las mejores decisiones.

Técnicas de diagnóstico

Según la información recopilada, existen diversos métodos de diagnóstico para los patógenos bacterianos. En el laboratorio Aquagestión, por ejemplo, estos análisis se realizan utilizando, principalmente, biología molecular, también conocido como PCR (Polymerase Chain Reaction). Este método se caracteriza por ser sumamente rápido y preciso. La firma también utiliza métodos complementarios, como la histopatología, además de la técnica inminodiagnóstica “Elisa”.

“En el último periodo, ha repuntado el inmunodiagnóstico, por ejemplo para analizar BKD, que es un agente un poco más complejo en la detección y donde la prevalencia asintomática es alta. Este patógeno a veces pasa sin detectarse por un periodo más o menos prolongado. Por lo tanto, el Elisa sirve de apoyo y permite hacer diagnósticos o estudios de prevalencia un poco más ampliados”, dice el jefe del Área de Laboratorios de Aquagestión, Emiliano Rivera.

Desde ADL Diagnostic Chile, en tanto, informan que ellos manejan técnicas indirectas o directas. Las técnicas indirectas o rápidas, son aquellas que permiten detectar un metabolito o parte del patógeno y que, en general, están listas en minutos u horas. Las técnicas directas corresponden a aquellas donde el patógeno se observa directamente o se aísla o concentra y que en general tiene tiempos de respuesta en días o semanas. 

El gerente general del laboratorio, Patricio Bustos, explica que, en general, para las enfermedades bacterianas, se utilizan técnicas indirectas o rápidas, como es el PCR tiempo real, sobre todo si se requiere una respuesta con urgencia. Por otro lado, si se sospecha de una enfermedad bacteriana desconocida y posiblemente emergente o exótica, así como posibles bacterias fastidiosas (que requieren medios enriquecidos para crecer) o no fastidiosas, en ADL utilizan técnicas directas, como la observación por microscopía –tinción Gram–, histopatología e incluso paralelamente el cultivo bacteriológico en distintos medios de cultivo, según tipo de agua (dulce, estuario o mar). 

ADL Diagnostic Chile también cuenta con la técnica ATBPlex®, desarrollada y patentada por la empresa hace cinco años, la cual permite determinar mutaciones específicas en el genoma de Piscirickettsia salmonis, relacionadas con la susceptibilidad de la bacteria a determinados antibióticos de uso frecuente. 

Pathovet, por su parte, utiliza técnicas de diagnóstico como la necropsia, histología, PCR, tinción Gram, inmunohistopatología y técnicas Elisa. Además, ofrecen servicios de cultivo bacteriológico, “donde se realizan cultivos e identificación de las diferentes bacterias de importancia en la industria, como Renibacterium salmoninarums, P. salmonis, Flavobacterium, Aeromona salmonicida, Tenacibaculum maritimum, Tenacibaculum dicentrarchi y en realidad todas las más prevalentes”, de acuerdo con el gerente general de la firma, Marco Rozas. 

Fishvet Group Chile, por su parte, realiza tinción Gram, microbiología, inmunofluorescencia, Elisa, biología molecular por PCR, secuenciación (parcial y masiva) y microscopía electrónica. “El tema del diagnóstico bacteriano es bastante importante. En la práctica, todos hemos ido traspasando técnicas de diagnóstico humano a los peces”, dice su gerente general, Javier Moya. 

Pero, ¿cómo se hace para diferenciar las distintas cepas? De acuerdo con Javier Moya, hay varias formas de hacerlo. Se pueden utilizar medios de cultivo solido enriquecidos o específicos, donde crecen unas bacterias y no crecen otras. También se puede aplicar inmunofluorescencia o Elisa, que ocupa anticuerpos específicos a un patógeno. Asimismo, la biología molecular por PCR tiene especificidad para genomas de los patógenos en particular. 

“También está la posibilidad de que, cuando tienes algún patógeno que no sabes cuál es, sino que tienes una noción de que es bacteriano, puedes hacer una secuenciación de ciertas zonas y ahí ver qué genoma y qué bacteria es. Y si ya tampoco tienes ese dato, puedes utilizar secuenciación masiva”, explica el ejecutivo.

Avances en rapidez y logística

Hoy, la industria del salmón cuenta con un servicio de diagnóstico de patologías bastante avanzado, rápido y preciso. Desde Aquagestión cuentan que en la actualidad, “el tiempo de respuesta es convenido con cada cliente. Por ejemplo, si este tiene una urgencia, podemos entregar el resultado en lo que demore la extracción y PCR, que puede tardar entre 3 a 4 horas. Todo depende de los casos. Lo cierto es que si alguien tiene una contingencia, se coordina todo para obtener el resultado en la mayor brevedad posible”. 

Ahora, para un análisis normal, los PCR para patógenos generalmente tardan dos días. La histología en tanto, demora unos cuatro días, mientras que los cultivos bacteriológicos pueden ocupar una semana, dependiendo de la bacteria. Para Elisa se requieren unos dos días, mientras que la inmunohistoquímica puede tardar varios días.

En cuanto a la obtención de muestras, en general, se manejan dos líneas de acción. Una consiste en que personas capacitadas y certificadas de los mismos laboratorios se dirijan a los centros de cultivo a tomar las muestras, mientras que la otra consiste en que los clientes hagan llegar las muestras, por sus propios medios. Sin embargo, por diversos factores muchas veces la logística puede ser un  problema debido a la lejanía de algunos centros de producción. Para abordar esta problemática, varios laboratorios han instalado oficinas en algunos sitios de alta demanda, como en La Araucanía, Isla de Chiloé, Aysén y/o Magallanes. 

Además, los laboratorios tienen estrictos protocolos para asegurarse de que las muestras sean apropiadas. “Tenemos un protocolo de aceptación o rechazo de muestras. Todo pasa por un control de calidad. Además, los robots hacen un control de calidad secundario y dicen ´no´, la muestra no tiene la consistencia que se necesita o el volumen no es el requerido. Hay hartas barreras antes de hacer los análisis”, enfatiza Javier Moya, de Fish Vet Group Chile.

Análisis a distancia

La tecnología disponible ha permitido que se haga cada vez más frecuente la práctica de la medicina “a distancia”. En salud humana aquello está fuertemente arraigado. En acuicultura, también se están haciendo esfuerzos. En los análisis histopatológicos, por ejemplo, hoy es bastante común que los laboratorios locales puedan compartir imágenes con expertos en el extranjero, tanto de sus mismas compañías, o con especialistas con los cuales tienen convenios.

Desde ADL Diagnostic Chile, por ejemplo, cuentan que tienen una alianza con el laboratorio VeHiCe, quienes realizan los análisis histopatológicos y cuentan con un reconocido sistema nacional e internacional de análisis por telemedicina. Aquí, “histopatólogos del país y sobre todo del extranjero pueden analizar las imágenes desde sus oficinas en cualquier lugar del mundo”, dice Patricio Bustos.

En el caso de Pathovet, destacan los productos que han originado a través de la empresa relacionada Newenko Group. El primero de ellos es un kit de terreno, que no necesita equipamientos ni gente calificada para su operación y que en alrededor de 1 ½ hora puede detectar SRS molecularmente. El otro producto es un software “que es un producto basado para la telepatología, donde nuestros clientes toman fotos en los centros de cultivo, la suben a una aplicación que puede ser web o móvil, y se confirma el diagnóstico mediante inteligencia artificial”, de acuerdo con Marco Rozas. Esta última iniciativa está a punto de terminar su fase de desarrollo, trabajando de cerca con el Servicio Nacional de Pesca y Acuicultura y algunas salmonicultoras chilenas.

Según lo explicado en la ocasión, el proyecto estuvo enmarcado dentro del Programa para la Gestión Sanitaria en la Acuicultura (PSGA), liderado por el Servicio Nacional de Pesca y Acuicultura (Sernapesca) y con la cooperación del Instituto Tecnológico del Salmón (Intesal) de SalmonChile. 

Durante el seminario, el Dr. Ricardo Henríquez, de la UACh, expuso que el objetivo general de la iniciativa fue identificar patrones de co-ocurrencia y sucesión temporal de distintas enfermedades infecciosas prevalentes en presencia de Piscirickettsiosis (SRS); en este contexto, la co-ocurrencia podría tratarse de una co-infección o co-morbilidad. Entre los objetivos específicos se contemplaba describir epidemiológicamente las co-ocurrencias infecciosas en centros con diagnóstico de SRS; caracterizar patrones y sucesión temporal de enfermedades infecciosas prevalentes con SRS; analizar molecular, clínica e histopatológicamente la co-ocurrencia entre SRS con las enfermedades/patógenos causantes BKD, IPN, PRV/HSMI; y evaluar el efecto y respuesta de una población que estaban naturalmente positiva a PRV-1 de manera masiva,  la cual se le realizó una infección experimental con Piscirickettsia salmonis (SRS) mediante cohabitación.

La Dra. Carla Rosenfeld, también de la UACh, realizó un estudio epidemiológico descriptivo longitudinal y retrospectivo, tomando la información registrada ante Sernapesca durante seis años (2011-2018) de 121 centros de cultivo que mantuvieron actuvos de manera inenterrumpida, que representan el 27,5 de los centros activos anualmente. Se analizaron alrededor de 120.000 datos de unos 31 barrios, donde se cultivaban las tres especies de salmónidos presentes en Chile. 

¿Los resultados? De acuerdo con el gerente general de ADL Chile, Patricio Bustos, la iniciativa arrojó interesantes hallazgos que permiten entender mejor la relación entre SRS y otros agentes patógenos/enfermedades co-ocurriendo de manera simultánea. Detalló que luego de haber estudiado la sucesión temporal de las enfermedades, haciendo una relación entre los agentes más relevantes en la salmonicultura local, se pudo apreciar que enfermedades tales como IPN, Tenacibaculosis, HSMI y BKD no generan predisposición de SRS, pero sí concomitancia. Este resultado es importante y robusto puesto que estamos hablando de una alta representatividad.… “121 centros de cultivo, con información de seis años”, manifestó.

“De igual forma, cuando hicimos una evaluación de la co-ocurrencia (co-infecciones, co-morbilidad, infecciones mixtas), advertimos que la condición co-ocurrente más detectada fue SRS con lesiones branquiales (trastornos proliferativos y vasculares), algo observado que es consistente con lo obsrvado en los últimos años. Adicionalmente, se pudo constatar algo que sospechábamos y es que el actual sistema de clasificación y registro de enfermedades imperante no permite la mayor parte del tiempo incorporar condiciones patológicas co-ocurrentes sino sólo registrar una sola enfermedad, aquella cuya signología prevalece, aún cuando suele ocurrir muchas veces nfecciones mixtas o co-ocurrentes”, indicó el ejecutivo. Según lo explicado, se pudo apreciar que en más del 78% de los centros analizados se presentaban entre tres a cinco patógenos juntos, donde uno predominaba, siendo éste el que se terminaba informando. A juicio de Patricio Bustos, como resultado del proyecto se proponen alternativas de mejora para el control de enfermedades, no persigue por ahora proponer modificaciones en las normativas actualmente vigentes. 

Otro dato que se entregó es que los factores que determinan la presentación de mortalidades/brotes, son propios de cada barrio y del ambiente o centros que lo componen, existiendo un endemismo de SRS en los barrios, representado por tres grupos claros identificados: los de mortalidad alta, mortalidad baja y los de persistencia. Otro dato detectado interesante es  que en la medida que aumenta el peso de los peces, se aprecia una mayor positividad de SRS y BKD, pero no ocurre lo mismo con PRV-1 y Tenacibaculosis, apareciendo estas últimas en cualquier momento después de escasos meses post-siembra en mar. Otra de las observaciones interesantes del proyecto, es que experimentalmente, la infección natural previa de PRV-1 no acentúa la signología asociada con la infección con P. salmonis, no hay sinergia para uno u otr lado. En otras palabras, PRV -1 no promovió SRS, sin embaargo noo podemos decir a la fecha que PRV-1 protege o no contra SRS, es algo que se desea investigar a futuro y que sería muy interesante tener una noción más clara dada la altísima prevalencia de PRV-1 en centrosw de may y agua dulce.

En cuanto a la co-infección entre PRV-1 y SRS, la Dra. Isabel Aguirre, de la UACh, explicó que se hizo un estudio donde se tomó una población positiva a PRV1, con una alta carga de infección y bastante pareja, y se la sometió a un desafío por cohabitación con SRS.  Lo que se esperaba es que SRS mostrara una rápida evolución, o que PRV aumente su intensidad. Sin embargo, estudiando mortalidades y marcadores de inmunidad, se pudo ver que no había una tendencia en la expresión de genes asociados a la inmunidad para una enfermedad infecciosa viral o bacteriana. En rigor, los peces no se enfermaron de SRS y ninguna patología predispuso a la otra. Se espera, a partir de estos resultados, poder hacer más pruebas en el futuro, con el fin de comprobar, por ejemplo, si PRV-1 pudiera ser protector contra SRS.

Detección temprana

Durante el encuentro, la Dra. Carla Rosenfeld explicó también una nueva herramienta –propuesta por el mismo equipo de investigación– que fue analizada en el estudio y que permitiría tener un diagnóstico precoz, como es el caso del control estadístico de procesos. Se trata de una propuesta nueva que permite complementarla con otras propuestas y con aquellos procedimientos implementados ya por las empresas. Lo cierto es que se espera trabajar aún más esta iniciativa, validarla en acuicultura, algo que la propia Dra. Rosenfeld propuso para aves y cerdos y ha estado aplicándose de manera efectiva hasta la fecha. Ciertamente, las empresas han desarrollado sistemas eficientes de diagnóstico precoz de SRS en los centros, de manera que esta alternativa propuesta podría mejorar aún más el control de SRS, pero es aplicable a otras enfermedad en tanto poseen endemismo, es decir sean endémicas y con presentación relativamente frecuente en los centros.